Ученые вывели секвенирование одномолекулярной ДНК на новый уровень

В последние годы технологии, которые позволяют ученым изучать ДНК человека с разрешением в одну молекулу, значительно расширили наши знания о человеческом геноме, микробиоме и генетической основе болезней. При таком детальном рассмотрении ДНК можно увидеть генетические варианты и структурные детали, которые просто невозможно было обнаружить с помощью более ранних технологий секвенирования.

Однако современные методы анализа одиночных молекул, ставшие золотым стандартом, обычно требуют как минимум 150 000 человеческих клеток, содержащих миллионы отдельных молекул ДНК. Это означает, что исследователи не могут применять эти инструменты, когда доступно всего несколько тысяч клеток, например, при биопсии многих опухолей, что ограничивает научный и клинический потенциал этих технологий.

Теперь исследователи из Института Гладстона разработали два новых инструмента для анализа одиночных молекул, которые сокращают необходимое количество ДНК на 90–95%. Их работа, опубликовано в журнале Природная генетикапоказывает, как эти инструменты могут позволить ученым решать биологические вопросы, на которые они раньше не могли ответить.

«Мы очень долго работали над созданием этих методов», — говорит Виджай Рамани, доктор философии, помощник исследователя в Гладстоне и старший автор исследования. «Мы очень рады видеть, какие открытия теперь станут возможными».

«Пометка» ДНК для более четкого представления

Первый из новых инструментов, известный как «секвенирование одной молекулы в реальном времени путем тагментации» или SMRT-Tag, расширяет существующие протоколы для одновременного картирования последовательности оснований в длинном фрагменте ДНК и местоположений химических структур, называемых метильными группами. которые лежат по длине ДНК. Метильные группы играют ключевую роль в экспрессии генов, что делает их важными для понимания болезней, поэтому важно посмотреть, как они расположены в ДНК.

«Когда у нас очень мало ДНК для работы, мы не можем просто сделать больше копий ДНК и применить наши обычные протоколы», — говорит Рамани. «Создание копий устранит эти закономерности метилирования и приведет к другим ошибкам».

Вместо этого его команда адаптировала подход под названием «тагментация», который переназначает бактериальный белок Tn5 для одновременного разрезания молекул ДНК на более удобные фрагменты и пометки их химическими компонентами, необходимыми для дальнейшего анализа.

Тагментация уже используется для секвенирования коротких фрагментов ДНК, когда доступны лишь небольшие количества ДНК, но из коротких фрагментов можно получить лишь ограниченную информацию.

Задача команды Рамани заключалась в том, чтобы разработать биохимию тагментации, подходящую для разделения небольших количеств ДНК на длинные куски длиной от 3000 до 5000 пар оснований. Их метод «помечает» концы каждого фрагмента структурами в форме шпильки, создавая длинные петли ДНК, которые можно надежно прочитать с помощью секвенатора.

«Сотрудники и студенты моей лаборатории приложили героические усилия», — говорит Рамани. «Нам пришлось протестировать разные версии Tn5 и почти 100 различных условий с разными буферами, ферментами и температурами. Когда вы работаете с такими небольшими количествами ДНК, любая проблема, которая приводит к потере ДНК, становится гораздо более серьезной проблемой. “

Полезные данные из небольших выборок

После оптимизации SMRT-Tag команда продемонстрировала, что он работает так же хорошо, как установленные протоколы, но использует гораздо меньшее количество ДНК — примерно такое же количество, которое содержится всего в 10 000 клетках.

«Используя аппаратуру для секвенирования одиночных молекул, являющуюся золотым стандартом, никто никогда не секвенировал такое небольшое количество ДНК с таким охватом, которого мы достигли сейчас», — говорит Рамани.

Затем его команда объединила SMRT-Tag с ранее разработанным ими методом под названием SAMOSA, сокращенно от «анализ секвенирования одномолекулярных метилированных олигонуклеосом аденина».

SAMOSA обнаруживает дополнительные закономерности метилирования, которые отражают доступность хроматина или то, насколько легко механизмы экспрессии генов могут получить доступ к различным участкам ДНК.

Теперь, с помощью нового инструмента SAMOSA-Tag, исследователи смогли оценить доступность хроматина, используя гораздо меньше ДНК, чем требовалось ранее. Чтобы продемонстрировать это, они применили его к клеткам рака простаты — некоторым из первичной опухоли пациента и некоторым из опухоли, которая распространилась в другое место в организме — которые были трансплантированы и выращены на мышах. Метод выявил различия в доступности хроматина, которые намекают на возможные ключевые факторы метастазирования рака.

«Это всего лишь один пример того, как наши инструменты могут быть применены к клинически значимым образцам при раке и других заболеваниях, при которых ДНК не хватает», — говорит Шива Касинатан, доктор медицинских наук, который руководил исследованием вместе с Рамани. «Мы думаем, что здесь есть некоторые легко висящие плоды, которые могут открыть новую биологию, которая может быть важна для помощи пациентам в будущем».

Касинатан, научный сотрудник детской больницы Люсиль Паккард при Стэнфордском университете, приглашенный ученый в Гладстоне и давний сотрудник Рамани.

В настоящее время команда Рамани оптимизирует SMRT-Tag и SAMOSA-Tag для работы с еще меньшими объемами ДНК. Они также продолжают делиться и регулярно обновлять свои протоколы в Интернете, приглашая к отзывам и сотрудничеству других исследователей. «Сообщество и вовлеченные люди действительно важны в истории этой работы», — говорит Рамани.

В частности, он особо выделяет свою работу с Касинатаном, с которым познакомился, когда они вместе учились в аспирантуре Вашингтонского университета. Вместе они разработали концепцию исследования. «Было очень важно работать с одним из моих самых близких друзей над публикацией того, что, по нашему мнению, будет очень полезно для здоровья человека».